Bradford -metoden hva er, prinsipp, reagenser, bruker

Han Bradford -metoden Det er en kolorimetrisk metode som for tiden brukes for rask estimering av total proteinkonsentrasjon i biologiske eksperimenteringsprøver. Det brukes i mange felt av biologisk, medisinsk, veterinær, agronomisk forskning, etc.

Det er kjent som "Bradford Method" fordi den først ble beskrevet av Marion Bradford i 1976, i publikasjonen med tittelen En rask og sensitiv metode for kvantifisering av proteiner i mengder mikrogram ved bruk av prinsippet om protein-youth union.

Fotografi av en ELISA-plakett der prøver har forberedt seg på en Bradford-kvantifisering (kilde: Helito, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Siden forslaget har denne metoden blitt populær popularisert, ettersom den anerkjennes mer følsom enn andre proteinkvantifiseringsmetoder (for eksempel Lowry og Biuret, for eksempel); mer stabil kompleks form og er økonomisk og enkel å utføre.

I tillegg er det vist at reagensene de bruker har veldig liten interferens i spektrofotometriske målinger under forskjellige forhold.

[TOC]

Metodeprinsipp

Bradfords metode er basert på kvantifisering av fargeendringer i en løsning på grunn av unionen - under sure forhold - av proteinmolekylene til en prøve med molekylene til et spesielt fargestoff: Coomassie Blue Strålende blå G250.

Når dette fargestoffet tilsettes en proteinløsning, binder det seg til disse molekylene gjennom elektrostatiske krefter, og denne reaksjonen er bevist som en rødbrun fargeendring til blå til blå.

Proteiner og aminosyrer

Akkurat som kroppen dannes av mange celler og nukleinsyrer (slik som DNA og RNA) dannes av nukleotider, dannes proteiner av bestilte sekvenser av noen molekyler kjent som aminosyrer.

En aminosyre er et molekyl sammensatt av et sentralt karbonatom som 4 forskjellige kjemiske grupper er sammen med: et hydrogenatom, en karboksylgruppe, en aminogruppe og en gruppe eller sidekjede, som gir identiteten.

Det er 20 aminosyrer som er vanlige for alle proteiner, som skiller seg fra hverandre med hensyn til egenskapene til sidegruppene: det er grunnleggende aminosyrer, syrer, polare, apolar, syklisk, aromatisk, etc.

Kan tjene deg: Shelfords toleranselov: Hva er og eksempler

Summen av egenskapene til disse aminosyrene og rekkefølgen de blir med for å danne proteinstrukturen gir hvert protein en serie av spesielle fysisk -kjemiske egenskaper, enten det gjelder belastningen, deres masse, deres hydrofobisitet, blant andre.

Tint-proteinkompleks

Bradfords metode kvantifiserer da tilstedeværelsen av aminosyrerester av basiske egenskaper i biologiske prøver, spesielt aminosyrer som arginin, lysin og histidin, som er de som lettere er plassert med Coomassie Blue.

Fargeendringer blir kvantifisert som variasjoner i absorbansen av prøvene, som måles ved bruk av et spektrofotometer justert til en bølgelengde på 595 nm.

Hva er absorbans?

Det er også kjent som optisk tetthet og definerer mengden lys som blir absorbert av en løsning. Denne absorpsjonen avhenger av bølgelengden til lyset som brukes til å bestøle løsningen, siden ikke alle molekyler er i stand til å absorbere den samme bølgelengden.

Dette fenomenet ble oppsummert i en lov kjent som Beer-Lamberts lov, som etablerer forholdet mellom reduksjonen i mengden lys som går gjennom et stoff og egenskapene til nevnte stoff.

For eksempel, når et lys overføres gjennom en løsning, er det to intensitetstiltak: en hendelsesintensitet (før du krysser løsningen) og en overført intensitet (generelt lavere, som tilsvarer brøkdelen av lys som ikke ble absorbert av løsningen).

Forholdet mellom begge verdiene er det som er kjent som prosessering og har verdier mellom 0 og 1 eller uttrykkes i prosentvis vilkår.

Absorbans er relatert til prosessering av logaritmisk måte, og øl-Lamberts lov foreslår et lineært forhold mellom absorbansen av en løsning og dens konsentrasjon, dens koeffisient for molutryddelse og den optiske koeffisienten til løsningen; Den matematiske ligningen som beskriver denne loven er som følger:

Kan tjene deg: skadelig fauna: årsaker til spredning, konsekvenser, kontroll

A (absorbans) = ε (molar utryddelseskoeffisient) C (konsentrasjon) L (lyspasslengde)

Konsentrasjonen av en løsning beregnes ved å rydde nevnte ukjent av ligningen og utføre de relevante beregningene (c = a/εl)

Hva er et spektrofotometer?

Det er en enhet som brukes til å kvantifisere mengden lys (avhengig av bølgelengden) som absorberer molekylene i en løsning eller, med andre ord, mengden lys de passerer.

Spektrofotometre fungerer ved å avgi en lysstråle (synlig eller ultrafiolett) som passerer gjennom et prisme (eller en enhet kjent som Diffraksjonsnettverksmonokromator) som bryter det ned i de forskjellige bølgelengdene som utgjør det, slik at de "velger" en bestemt lengde.

Dette lyset føres gjennom et spesielt rør som inneholder prøven som blir analysert og deretter når en detektor som oppfatter mengden lys som overføres fra nevnte prøve (som ikke ble absorbert) som kan observeres senere takket være en "tolk" som har et grafisk grensesnitt.

Fargestoffet: coomassie blå Strålende blå G 250

Det viktigste reagenset i denne metoden er uten tvil fargestoffet som ble brukt til å "merke" proteinene i prøven. Bradford foreslo jobben sin fordi dette fargestoffet eksisterer på to måter: en rød og en blå. Den røde formen blir den blå formen når fargestoffet binder seg til et protein, og danner et kompleks.

Det blå proteinblå komplekset har en veldig høy molar utryddelseskoeffisient, noe som resulterer i større følsomhet for kvantifisering av proteinkonsentrasjonen i de analyserte prøvene.

Reagenser

Selv om løsningen som brukes til denne kvantifiseringsmetoden generelt markedsføres i lukkede containere, allerede utarbeidet -"Bradford Reactive" -er de viktigste reagensene som brukes:

- Coomassie Blue Strålende blå G50 (0.01% vekt/volum)

- Fosforsyre (8.5 % vekt/volum)

- Etanol (4.7% vekt/volum)

Proteinkvantifiseringssett etter Bradfords metode (Kilde: Vivo Rolfe, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Som i enhver metode og proteinkvantifiseringsprotokoll ved spektrofotometriske metoder, er det nødvendig å ha et "standard" eller "standard" protein for å utføre en Kalibreringskurve for å bestemme absorbansverdiene relatert til forskjellige konsentrasjoner av protein; Generelt brukes bovint serumalbumin.

Kan servere deg: sjokolade agar

Metoden består i å blande visse volum av prøvene problem med visse volum av Bradfords reagens; Vent et par minutter på fargestoff-proteininteraksjon og fargeendring er tydelig og deretter målt og registrer absorbansverdiene for å utføre påfølgende beregninger.

Bruk/applikasjoner

Bradfords metode er en av kvantifiserings- eller estimeringsmetodene for den mest brukte proteinkonsentrasjonen i verden, hovedsakelig på grunn av dens lave kostnader, til den hastigheten som resultatene oppnås, til den store stabiliteten mellom proteinet og fargestoffet som ble brukt, til dens reproduserbarhet og minimum interferens som komponentene i reagensene som ble brukt under målingen har.

Metoden brukes i hundrevis av forskjellige vitenskapelige anvendelser for bestemmelse av proteiner i forskjellige sammenhenger: fysiologiske, cytologiske, immunologiske, kliniske, industrielle (spesielt i matindustrien), etc.

Eksperimentelt er denne metoden veldig nyttig for:

• Overvåk mengden protein som er inneholdt i volumene som gradvis er oppnådd fra en kromatografisk kolonne (i affinitetssøyler, ionebytte, absorpsjon, gelfiltrering, blant andre) I.og. Analyser fraksjoner av proteinrensingsprotokoller.
• Overvåk mengden protein som er lastet i en gel for elektroforese.
• Estimere mengden protein oppnådd i et overuttrykkssystem.

Referanser

1. Bonjoch, n. P., & Tamayo, P. R. (2001). Proteininnholdskvantifisering av Bradford -metoden. I Handbook of Plant Ecophysiology Techniques (PP. 283-295). Springer, Dordrecht.
2. Bradford, m. M. (1976). En rask og sensitiv metode for kvantifisering av mikrogrammengder av protein ved bruk av hovedproteindagen binding. Analytisk biokjemi, 72 (1-2), 248-254.
3. Kielkopf, ca. L., Bauer, w., & Urbatsch, jeg. L. (2020). Bradford -analyse for å bestemme proteinkonsentrasjon. Cold Spring Harbor Protocols, 2020 (4), PDB-Prot102269.
4. Sapan, c. V., Lundblad, r. L., & Price, n. C. (1999). Colorimetric Protein Analyseteknikker. Biotechnology and Applied Biochemistry, 29 (2), 99-108.
5. Walker, J. M. (Red.). (nitten nittiseks). Proteinprotokollens håndbok (Vol. nitten nittiseks). Springer Science & Business Media.