Proteinase K -egenskaper, enzymatisk aktivitet, applikasjoner

De Proteina k Det er et enzym som tilhører gruppen av serinproteaser, det vil si at det i sitt aktive katalytiske sentrum en serinaminosyre og har funksjonen å bryte peptidbindinger ved hydrolyse. På sin side tilhører dette enzymet familien til subtilisinproteiner (peptidase S8).

K -proteinasen har en molekylvekt (PM) på 28.900 daltoner og ble først isolert i 1.974 i soppekstrakter Engyodontium -album, tidligere kjent som navnet på Tritirachium -albumet Limber.

Molekylstruktur av K -proteinasen. Kilde: Lykchiniadis [CC BY-SA 4.0 (https: // creativecommons.Org/lisenser/by-SA/4.0)]

Den presenterer en høy proteolytisk kapasitet, demonstrert ved å kunne nedbryte keratinet som er til stede i håret. Ordet keratin på engelsk er skrevet "keratin", derfra kommer det at det har blitt kalt "proteininsa k".

På grunn av sin høye kraft til å dele innfødte proteiner, er dette enzymet nyttig i forskjellige teknikker for molekylærbiologi. Hovedsakelig brukt til å isolere og fremstille nukleinsyrer med høy molekylvekt (PM).

K -proteinasen virker ved å frigjøre det nukleære DNA, mens de ødelegger proteiner og inaktive til RNaser og DNate, det vil si eliminerer nukleas i DNA og RNA -preparater.

På den annen side har det blitt sett at K -proteinase kan hydrolysere noen denaturerte naturlige proteiner, noe som har gjort interessen til forskerne til bruk i studiet av prionproteiner (PRPC).

Til tross for sin høye proteolytiske kraft er det imidlertid proteiner som er resistente mot virkningen av K -protein. Blant dem er det noen anomale proteiner kalt prioner (PRPSC), assosiert med overførbare spongiform encefalopatier.

[TOC]

Kjennetegn på proteinasen K

K -proteinasen har en tertiær struktur som består av tre lag, med et β -ark med syv medisinske kjeder mellom to lag med propeller. For å tilhøre familien til peptidaser er S8 karakterisert ved å presentere en katalytisk triade på det aktive stedet, hvis sekvensielle rekkefølge er (ASP, hans og vesen), som skiller dem fra andre peptidase -familier.

Det kan tjene deg: proteinaminosyrer

Dette enzymet i serinproteasegruppen er preget av hydrolyserende peptidbindinger nær den karboksyliske gruppen av alifatiske og aromatiske aminosyrer.

På den annen side er den i stand til å handle i nærvær av visse etsende stoffer, for eksempel natriumdodecilsulfat (SDS), Tris-HCl og EDTA, som brukes til å hjelpe denaturering av proteiner, noe som får dem til å miste sin opprinnelige struktur.

Dette er et tidligere trinn i fremstilling av proteiner for elektroforeseteknikken. PH -området som K -proteinene virker er ganske bredt (2.0 til 12.0), med en optimal pH mellom 7.5 til 12.0, og dets isoelektriske punkt er 8.9. Som det kan sees, er det aktivt mot et veldig bredt spekter av pH.

En annen funksjon som skiller seg ut i K -proteinasen er dens stabilitet i nærvær av høye temperaturer (50 - 60 ° C).

Enzymatisk aktivitet

K -proteina trenger tilstedeværelsen av kalsiumion, selv om det ikke påvirker dens aktivitet, hvis det er viktig å opprettholde sin stabilitet.

For at K -proteinene skal utføre fullstendig fordøyelse av underlaget, er en omtrentlig kontakttid nødvendig mellom 5 minutter opp til 2 timer.

I denne forstand sammenlignet imidlertid Daza og samarbeidspartnere renheten til DNA som ble oppnådd ved flere eksponeringstider mot K -proteinasen, og konkluderte med at en langvarig inkubering (opptil 24 timer) forbedrer kvaliteten på DNA betydelig.

Nå, i forhold til konsentrasjonen som ble brukt av K -proteinase -enzymet i de forskjellige protokollene, kan det sies at det er veldig variert.

Det kan brukes fra veldig lave konsentrasjoner (5 ug/ml) til 500 ug/ml konsentrasjoner. Men de hyppigste arbeidskonsentrasjonene varierer mellom 50-100μg /ml, spesielt for proteinfordøyelse og nukleas. Selv om det er nødvendig for vevsbehandling på 2 mg/ml.

Kan tjene deg: easmotherium sibiricum: egenskaper, habitat, fossiler

applikasjoner

Deres applikasjoner er veldig brede og kan oppsummeres i følgende:

-Det brukes i proteinfordøyelse og DNA-ekstraksjon ved flere metoder som: Salting-out, PK-SDS, cetyl-tritetyl ammonium (CTAB), modifisert kaliumacetat og natriumjodidekstraksjonsacetat.

-Inaktivering av Nucleasas (RNASAS og DNASAS).

-I hybridiseringsteknikken In situ (Hans), for å hjelpe frigjøring av nukleinsyre, i tillegg til å eliminere uønskede proteiner.

-Proteinmodifisering.

-På forskningsnivå, i forskjellige studier.

Fordeler med K -proteinase

Ulike komparative studier er blitt utført mellom DNA -ekstraksjonsteknikker som bruker K -proteinase, med andre som ikke bruker det, og alle konkluderer med at det er større fordeler når enzymet brukes. Blant fordelene kan følgende nevnes:

-DNA av høy molekylær, høy kvalitet og renhet oppnås.

-Det ekstraherte DNAet er stabilt i opptil 3 måneder.

DNA ekstrahert kan brukes i følgende teknikker: Southern blot, polymerasekjedereaksjon (PCR), elektroforese, blant andre.

Proteinase resistente K -proteiner

Ulike undersøkelser har konkludert med at prioner (giftige PRPSC -anomale proteiner skiller seg fra PRPC (native) proteiner ved å være resistente mot virkningen av K -proteinase, mens PRPC er følsomme for deres handling.

Andre forfattere har beskrevet at det i strukturen til PRPSC er sensitive porsjoner og andre motstandsdyktige mot K -proteinasen. Imidlertid er begge parter like giftige og smittsomme.

På den annen side isolerte Bastian og samarbeidspartnere i 1987 4 proteiner på 28, 30, 66 og 76 kDa fra en slags Spiroplasma mirum. Alle viste seg å være resistent mot virkningen av K -proteinasen og hadde også en kryssreaksjon med noen prioner.

Kan tjene deg: kjemotoksis

Det er kjent at denne arten kan forårsake viktige grå stær og nevrologiske skader, og på grunn av de vitenskapelige funnene fra Bastian, blant annet, har den prøvd å forholde seg til denne mikroorganismen med overførbar spongiform encephalopathies overførbar.

Imidlertid forblir etiologien til denne degenerative nevrologiske patologien for øyeblikket tilskrevet prioner.

I denne forstand identifiserte og karakteriserte Butler og samarbeidspartnere i 1991 en klasse av en 40 kD KDA -proteinase -motstandende fra to stammer fra to stammer av Mycoplasma hyorhinis. Dette patogenet påvirker griser, og infiserer vevet deres, men i dette tilfellet var det ingen kryssreaksjon med fengslene testet.

Mer forskning er nødvendig for å belyse mange ukjente i denne forbindelse.

Referanser

1. Bastian F, Jennings R, og Gardner w. 1987. Antiserum til skrapie-asosierte fibrilprotein kryssreagerer med Spiroplasma MIRUm Fibrilproteiner. J. Clin. Mikrobiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Evaluering av en DNA -ekstraksjons- og rensemetode fra muskelvev festet i formaldehydet av uidentifiserte lik.  Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, og McGarrity G. Identifisering og karakterisering av protein K-resistente proteiner hos medlemmer av klassen bløtdyr.  Infeksjon og immunitet, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Marocoima A, Herrera L, et al. Sammenligning av to DNA -ekstraksjonsprotokoller av Trypanosoma Cruzi dyrket i akshenisk medium. Rev. Peru. Med. Exp. Folkehelse  2014; 31 (2): 222-227. Tilgjengelig på: Scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E og Palma W. Bestemmelse av effektiviteten av fem DNA -ekstraksjonsprotokoller fra parafinert materiale for molekylære studier. Rev Méd Medic Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.