Dapi (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) egenskaper, foundation, bruk

Han Dapi (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) Det er et fargestoff som av dens lysstoffrør fungerer som en markør, og blir mye brukt i fluorescens eller flytcytometri -mikroskopiteknikk, blant andre. Fluorescensen den avgir er knallblå, spenningen skjer mellom 455-461 nm (UV-lys).

DAPI -fargestoffet kan krysse cellemembranen fra døde celler med stor letthet. Du kan også farge levende cellekjerner, men i dette tilfellet må konsentrasjonen av dette være større.

Kjemisk struktur av fluorescerende dyst. Kilde: Bilde: Fil: DAPI.SVG er en vektorversjon av denne filen. Det skal brukes i stedet for dette rasterbildet når det ikke er nedre/Richard Wheeler (Zephyris) [CC BY-SA 3.0 (http: // creativecommons.Org/lisenser/by-SA/3.0/)] Redigert bilde

Fargestoffet er i stand til å få tilgang til celle -DNAet som det har en spesiell affinitet, sammen med stor aviditet til adenin- og tyminens nitrogenbaser. Av denne grunn er det veldig nyttig i noen teknikker for molekylærbiologi.

Denne forbindelsen tilhører gruppen av indoliske fargestoffer og har vist å ha større følsomhet for DNA enn etidiumbromid og propidious jodid, spesielt om agarosegeler.

Bruken av dette fluorescerende fargestoffet er veldig bredt, siden det er nyttig for: å studere endringer i DNA i apoptotiske prosesser (celledød) og derfor oppdage celler i denne prosessen; for DNA -fotavtrykkfoto (fotografisk utskrift av DNA); å studere bakteriell forurensning; o For å visualisere atomsegmentering.

Det har også blitt brukt i studien av kromosomale bånd, i påvisning av DNA av Mycoplasmas sp, I DNA-protein-interaksjon, i farging og telling av celler ved immunofluorescens og til og med fargelegging av modne pollenkorn.

[TOC]

Kjennetegn

DAPI er forkortelsen av det kjemiske navnet (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Den molekylære formelen er C₁₆H_femtenN_5. Den har en molekylvekt på 350,3. Nær UV-lysområdet (345 til 358 nm) den maksimale eksitasjonen av DAPI-adn-komplekset oppstår, mens den maksimale fluorescensutslippet oppstår mellom 455-461 nm.

Dette fargestoffet er preget av å være et gult støv, men strukturene merket med denne fluoroforen avgir et knallblått lys.

Det er imidlertid en vannløselig forbindelse. Det kan fortynnes med PBS, men ikke løses direkte inn i dette.

Det kan tjene deg: arseniososyre (H3SO3): egenskaper, risikoer og bruk

Når fargestoffet er utarbeidet, må det lagres i mørket, det vil si beskyttet mot lys, ved en temperatur på 2 til 8 ° C (kjøleskap). Under disse forholdene er fargestoffet stabilt i mer enn 3 uker eller måneder.

Hvis lyset er beskyttet, men stabiliteten blir liggende ved romtemperatur til 2 eller 3 uker, men utsatt for direkte lys er forverringen veldig rask. Hvis du vil spare mye lenger, kan du kjøle ved -20 ° C distribuert i alikvoter.

Basis

Denne fargen er basert på å generere en kjernefysisk ansettelse i hovedteknikkene for molekylærbiologi, for eksempel: flytcytometri, fluorescensmikroskopi og farging av metafasiske kromosomer eller grensesnittkjerner, blant andre, blant andre.

Denne teknikken er basert på den store affiniteten som fargestoffet har for nitrogenholdige baser (adenin og timin) som er inneholdt i det genetiske materialet (DNA) i mindre rille. Mens på det cytoplasmatiske nivået etterlater veldig lite bunn.

Når foreningen av lysstofffargen til regionene adenin og timina for DNA oppstår, øker fluorescens betydelig (20 ganger mer). Fargen den avgir er knallblå. Det skal bemerkes at det ikke er utslipp av fluorescens når du binder til GC-basepar (guanina-citosin).

Det er viktig å fremheve at selv om det også har en affinitet for RNA, forårsaker det ikke noe problem, fordi den større grad av energiutslipp av dette molekylet oppstår til en annen bølgelengde (500 nm), i motsetning til DNA som gjør det til 460 nm. I tillegg er økningen i fluorescens en gang koblet til RNA bare 20%.

DAPI brukes mer til å farge døde (faste) celler som du lever, siden for å fargelegge sistnevnte er det behov for en mye høyere konsentrasjon av fargestoff.

DAPI -fargestoffet kan brukes i kombinasjon med røde og grønne fluoroforer for å oppnå en flerfarget opplevelse.

Bruk

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) er en utmerket fluorofor og er derfor mye brukt i forskjellige teknikker og til forskjellige formål. Bruken av DAPI er forklart nedenfor i hovedteknikkene.

Flowcytometri

Forskerne Gohde, Schumann og Zante i 1978 var de første som brukte og foreslo DAPI som en fluorofor i flytcytometri -teknikken, og hadde stor suksess på grunn av deres høye følsomhet med DNA og dens høye intensitet i utslippet av fluorescens.

Det kan tjene deg: en aminogruppe (NH2): Struktur, egenskaper, eksempler

Bruken av DAPI i denne teknikken, tillater studiet av cellesyklusen, kvantifisering av celler og farging av levende og døde celler.

Selv om det er andre fargestoffer, som etidiumbromid, Hoechst -oksid, akridinoransje og propidio iodid, er DAPI en av de mest brukte for å være mer fotograferte enn de som er nevnt ovenfor.

For denne teknikken er det nødvendig. Prøven er sentrifugert og supernatanten kasser.

Mens tiden passerer DAPI -fargestoffet med en fargingsbuffer (Foxp3 av Biolegend) til en 3 um.

Sentrifugue prøven, kast supernatanten og dekk deretter med 1 ml DAPI -løsning i 15 minutter ved romtemperatur.

Ta prøven til flytcytometeret med høyre laser.

Flow Microfluorometry

En annen teknikk der DAPI brukes i, er i mikrofluorometri av flyt sammen med en annen fluorofor som kalles mitramisk. Begge er nyttige for å kvantifisere.

Hybridisering In situ 

Denne teknikken bruker i utgangspunktet DNA -sonder merket med et lysstoffrør som kan være DAPI.

Prøven krever å bli behandlet med varme for å denaturalisere DNA -to -klassen og gjøre det til to monokypenekjeder. Deretter hybridiseres det med en DNA -DNA -sonde merket med DAPI som har en sekvens av interesse.

Deretter vaskes det for å eliminere det som ikke var hibrid, en kontrast brukes til å visualisere DNA. Fluorescensmikroskopet tillater observasjon av den hybridiserte sonden.

Denne teknikken er ment å oppdage spesifikke sekvenser i kromosomalt DNA, og kunne diagnostisere visse sykdommer.

Disse cito-molekylære teknikkene har vært nyttige for å bestemme detaljer i studiet av karyotypene. For eksempel har det vist regionene som er rike i par adenosin- og tyminbaser kalt heterokromatiske regioner eller DAPI -bånd.

Kan tjene deg: permeabilitet: konsept, enheter, faktorer, eksempler

Denne teknikken er mye brukt til studiet av kromosomer og kromatin i planter og dyr, så vel som i diagnosen prenatal og hematologiske patologier hos mennesket.

I denne teknikken er den anbefalte DAPI -konsentrasjonen 150 ng/ml i en tid på 15 minutter.

De allerede monterte lysbildene skal beskyttes mot lys ved 2-8 ° C.

Farging av immunofluorescens

Cellene er fikset med 4% paraformaldehyd. Hvis andre fargestoffer skal brukes, blir DAPI igjen på slutten som ansettelse og cellene med PBS -løsning i 15 minutter er dekket. Mens tiden går, forbered DAPI -løsningen som fortynner med PBS, slik at den endelige konsentrasjonen er 300 um.

Deretter blir overflødig PBS trukket ut og dekket med DAPI i 5 minutter. Vask flere ganger. Arket blir observert i et fluorescensmikroskop under riktig filter.

Sikkerhetsark

Denne forbindelsen må manipuleres nøye, fordi den er en forbindelse som har mutagene egenskaper. Aktivert karbon brukes til å eliminere denne forbindelsen av vandige oppløsninger som vil bli kastet.

Hansker, kappe og sikkerhetslinser skal brukes til å unngå ulykker med dette reagenset. Hvis kontakt eller slimkontakt oppstår, bør du vaske området med nok vann.

Du skal aldri røre om dette reagenset med munnen, bruk propipetter.

Ikke forurense reagenset med mikrobielle midler, siden dette vil resultere i feilaktige resultater.

Ikke fortynn DAPI -fargestoffet mer enn anbefalt, fordi kvaliteten på farging vil avta betydelig.

Ikke utsett reagenset for direkte lys, eller hold varmen fordi det reduserer fluorescensen.

Referanser

1. Brammer S, Toniazzo C og Poersch L. Vanlig gründe Cholars Na vegetabilske cytogenetika. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Tilgjengelig fra: Scielo.
2. Impath Laboratories. Dapi. Tilgjengelig på: Menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell Laboratories. 2019. Instruksjoner for bruk av DAPI. Tilgjengelig på Cycell.com
4. Elaosegi A, Sabater S. Konsepter og teknikker i elveøkologi. (2009). Redaksjonelle ruber, Spania. Tilgjengelig på: Bøker.Google.co.gå/
5. Novaes R, Penitent A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Bruk av fluorescens i en modifisert dissektormetode for å estimere antall myocytter i hjertevevet. Arq. BH -er. Kardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Tilgjengelig fra: Scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Tilstedeværelse av fytoplasma i Papayo (Carica Papaya) i Mexico. Chapingo Magazine. Horticulture Series, 2011; 17 (1), 47-50. Tilgjengelig på: Scielo.org.