Half Löwenstein-Jensen Foundation, forberedelse og bruk

Han Midt-Löwenstein-Jensen Det er et selektivt fast medium for isolering og utvikling av bakterier i slekten Mycobacterium, for eksempel Mycobacterium tuberculosis, M. Avium, blant andre, med unntak av Leprae -arten, som ikke er dyrkbar.

Bakterier av slekten Mycobacterium vokser ikke i konvensjonelle kulturmedier, derfor var det nødvendig å designe et spesielt middel for dets isolasjon. Det opprinnelige mediet ble opprettet av Löwenstein og ble deretter modifisert av Jensen.

Halve Löwenstein-Jensen med kolonier av Mycobacterium tuberkulose. Kilde: Agarwal et al / Biomed Central Ltd., Med tillatelse fra biologibildebiblioteket

Modifiseringen besto av eliminering av det røde fargestoffet i Kongo, og erstattet den for større konsentrasjon av malakittgrønn. Det endret også konsentrasjonene av magnesiumcitrat og monopotasisk fosfat.

Löwenstein-Lose-mediet inneholder for tiden en papatstivelse, asparragin, magnetisk sitrat, monopo-fase fosfat, magnetisk sulfat, malakittgrønn, nalidíxico acid, cycloheximid.

Mycobacteria er normalt isolert fra steder som ikke er sterile, for eksempel sputum, urin, abscesser, blant andre. Dette betyr at de fleste prøver vil inneholde den vanlige mikrobiota i området, pluss patogenet.

Det er grunnen til at Löwenstein-Jensen-mediet inneholder en serie hemmere i den.

I tillegg må prøver som kommer fra ikke-sterilt sted dekontamineres og nøytraliseres før de blir sådd i Löwenstein-Jensen-mediet.

[TOC]

Basis

Tilstedeværelsen av egg og glyserin i Löwenstein-Jensen-mediet stimulerer veksten av mykobakterier fordi de gir fettsyrer og proteiner som er nødvendige for utvikling av disse mikroorganismer.

Löwenstein-Jensen-mediet inneholder malakittgrønn, som er en medfølgende mikrobiotainhibitor. Men den inneholder også nalidíxic acid (35 ug/ml), som hemmer gram -negativ mikrobiota, cykloheksimid (400 ug/ml), som hemmer saprofytter sopp og gjær, og lynsjing (2 u/ml), som hemmer mikrobiota -gram -rama (2µ/ml), som hemmer soppen og gjæren, og lynsjing (2 u/ml), som hemmer soppen og gjær, og lynsjing (2 u/ml), som hemmer saprophytes sopp (.

Noen kommersielle hus foretrekker å legge til følgende kombinasjon av antibiotika: Polymixina B 200.000 enheter/L, amfotericin B 10 mg/l, karbenicillin 50 mg/l og trimetoprima 10 mg/l.

Dette mediet inneholder ikke agar, derfor oppstår størkning av mediet ved koagulering av albuminet som er til stede i egget under sterilisering.

Forberedelse

Vei 37,3 g av dehydrert medium i 600 ml destillert vann som tidligere er tilsatt 12 ml glyserol. Blandingen blir oppvarmet, ofte omrøring til den totale oppløsningen. Autoklavar mediet ved 121 ° C i 15 minutter.

Kan tjene deg: de 12 stadiene av menneskelig utvikling og dens egenskaper

På den annen side bør en homogen suspensjon på 1000 ml friske egg fremstilles under aseptiske forhold. Tilsett eggopphenget ved 600 ml fremstilt ved en temperatur på 50 - 60 ° C, og unngå luftbobler.

Antibiotikeløsninger tilsettes også etter sterilisering i autoklave.

Hell mediet i sterile testrør med en trådplugg. Varm rørene ved 85 ° C i 45 minutter i skråstilling.

Fargen på det tilberedte mediet er aguamaringrønt og kan presentere hvite punkter for tilstedeværelse av egglipider.

Medium pH må være 7,2 ± 0,2

Lagre kjøleskapene og beskyttet mot direkte lys til bruk. Synke før såing.

Det er en modifisering av mediet som kalles "Gruft -modifisering av Löwenstein Jensen". Denne inneholder de samme forbindelsene som det klassiske mediet, men RNA-5 mg/100 ml tilsettes, og som hemmere inneholder det malakittgrønn 0,025 g/100 ml, penicillin 50 U/ml og nalidíxico 35 ug/ml syre.

applikasjoner

Löwenstein-Jensen-mediet brukes til Mycobacteria-isolasjon, fra forskjellige typer prøver. Det anbefales å utføre en Ziehl-Neelsen-farging til enhver prøve der tilstedeværelsen av mykobakterier er mistenkt.

Noen prøver kommer fra sterile steder, men andre gjør det ikke. Ikke -ssterile prøver må dekontamineres ettersom tilfellet kan være:

Sputum

Sputumprøver må dekontamineres som følger: Bestem mengden sputumprøve i ml og tilsett samme mengde 4% NaOH og Incube til 37 ° C.

Rist blandingen ofte over en periode på 30 minutter. Deretter sentrifugue ved 3000 o / min i 30 minutter.

Kast supernatanten på en fenolisk desinfeksjonsløsning. Bruk så sedimentet, men først må pH -pH nøytraliseres.

For å nøytralisere sedimentet brukes h₂SW₄ ved 5% i nærvær av den røde fenolindikatoren til det fører til en nøytral pH som har sin opprinnelse en laksefarge.

Gastrisk vask, bronkialvask og bronkial aspirat

I dette tilfellet skal prøven være sentrifuge ved 3000 o / min i 30 minutter. Supernatanten blir kastet og sedimentet brukes. For å dekontaminere sedimentet tilsettes 3 ml 4% NaOH og ofte omrørt ved 37 ° C i en periode på en halv time.

Kan tjene deg: stroma (histologi)

Sentrifuge igjen, supernatanten blir kastet og sedimentet brukes. Det siste må nøytraliseres som forklart i sputumprøven.

Urin

La prøven i kjøleskapet i 24 timer. Skille supernatanten. Det gjenværende sedimentet må sentrifuges i 30 minutter ved 3000 RMP. Kast supernatanten igjen og rekonstitutt sedimentet med 3 ml steril fysiologisk løsning.

Tilsett 3 ml 4% NaOH og fortsett til dekontaminering og nøytralisering som beskrevet før.

Ascitisk væske, pleurvæske, cerebrospinalvæske

I denne typen prøve blir den sentrifugert og supernatanten kasseres. Lage et gram til sedimentet eller observere direkte i mikroskopet; Hvis bakterier ikke blir observert, er ikke passering av dekontaminering nødvendig og verken nøytraliseringen.

I dette tilfellet kan prøven såver direkte ved hjelp av sedimentet. Hvis det er bakterier, fortsett å dekontaminere og nøytralisere som beskrevet ovenfor.

Biopsier

Denne typen prøve skal tilsettes 5 ml destillert vann til senere sentrifuge ved 1500 o / min i 10 minutter. Kast supernatanten og sentrifugere sedimentet ved 3500 o / min i 30 minutter. Bruk sedimentet for å så kulturmediet.

Hiophare laryngeal

Pinnen må introduseres i et sterilt rør som inneholder like deler av destillert vann og 4% NaOH. Pinnen må trykkes på veggene i røret slik at prøven fortynnes i væsken. Sentrifuge og bruk sediment. Nøytralisere sedimentet som allerede beskrevet.

Sådd

Löwenstein-Jensen-mediene inokuleres ved å tilsette 0,5 ml av prøven på overflaten av mediet. Drei røret for å fordele prøven gjennom mediet. Ikke bruk platinahåndtak.

Du kan så et andre rør som inneholder halvt steinbrink for å isolere Mycobacterium Bovis og andre arter som ikke vokser i Löwenstein-Jensen-miljøet.

Inkubasjon

Inokulerte rør inkuberes i aerobiose ved 37 ° C, med et litt lat lokk og skråstilt ved omtrent 5 ° og beskyttet mot lys. Miljøet med karbondioksid kan berikes til 5-10%. Kontroller avlinger to ganger i uken til kolonienes utseende.

Det kan tjene deg: Nasal ekssudat: Hva er det for, prosedyre, dyrking

Når prøven er absorbert, justeres tapasene. Den maksimale inkubasjonstiden er 8 uker, hvis det etter denne tiden ikke er noen vekst rapporteres som negativ.

QA

Som kvalitetskontroll kan du bruke følgende stammer:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294,  Mycobacterium Kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium Bovis ATCC 19219, Mycobacterium Fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

For de tre første nevnte artene forventes det at det er en utmerket utvikling, til M. Forstuitum Veksten må være god, mens for M. Bovis knapp eller null vekst forventes. Mens arter annet enn slekten Mycobacterium må hemmet fullstendig.

Begrensninger

Det tilberedte mediet må beskytte seg mot lys, langvarig eksponering for lys gjør mediet vire fra grønt til blått, i dette tilfellet kan mediet ikke lenger brukes. Dette er fordi Malachites grønne er lysfølsom.

Mediet, ettersom det inneholder egg, kan lett forurenses hvis det ikke manipuleres aseptisk. Det kan oppløses hvis det er forurenset med proteolytiske bakterier.

Dyrking og manipulering av bakterier i slekten Mycobacterium krever kvalifisert personell, som er klar over biosikkerhetstiltakene som må oppfylles for å unngå å bli forurenset eller forurenset andre.

HCl skal ikke brukes i passering av nøytralisering på grunn av dannelsen av natriumklorid, som kan være giftig for Koch Bacillus.

Prøver må holdes nedkjøles og beskyttes mot lys så lenge de ikke blir behandlet.

Henvisning

1. Laboratories Francisco Soria Melgizo. 2009. Löwenstein-Jensen selektivt medium. Tilgjengelig på: F-Soria.er
2. Britania Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen medium. Tilgjengelig på: Britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen medium. Tilgjengelig på: Foodsafety.Neogen.com.
4. "Midt i Löwenstein-Jensen."" Wikipedia, gratis leksikon. 20. nov 2018, 15:15 UTC. 24. april 2019, 18:34. Wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Pan -American redaksjon S.TIL. Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 Ed. Pan -American redaksjon S.TIL. Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Biokjemiske tester for identifisering av bakterier for klinisk betydning. 3. utg. Pan -American redaksjon. Buenos Aires. Argentina.