Gramfarging

Gramfarging er nyttig for å visualisere forskjellige typer bakterier

Hva er Grams farging?

De Gramfarging Det er den enkleste og mest nyttige fargeleggsteknikken i diagnostisk mikrobiologi for å identifisere bakterier. Denne teknikken ble opprettet av den danske doktoren Christian Gram i 1884, som klassifiserte bakterier i gram -positivt (lilla) og gram -negativ (rosa), i henhold til sammensetningen av celleveggen.

Teknikken fikk visse modifikasjoner av Hucker i 1921 for å stabilisere reagenser og forbedre kvaliteten på farging, så Grams farging er også kjent som Gram-Hucker.

Med denne teknikken er det også mulig. Så vel som distribusjonen i rommet: i klynge, i kjede, isolert, par, i tetrader osv.

Basis

Det er en teknikk som presenterer 4 grunnleggende trinn: farging, fiksing med mordant, misfarging og ansettelse. Derfor, i tillegg til å fargelegge bakterier, lar det deg også differensiere dem.

Violet krystall er det første fargestoffet som ble brukt. Det samme har en affinitet for peptidoglykanen og vil farge alle bakteriene som er til stede, deretter plassert Lugol, som fungerer som en mordant, det vil si at den vil indusere dannelsen av uoppløselige komplekser av fiolett glass/jod/ribonukleære proteiner inne i cellen.

Gram -positive bakterier, med en tykk peptidoglykansk vegg, danner mer kompleks (fiolett/jodglass), derfor vil de være farget lilla.

Det påvirker også at veggen av gram -positive bakterier inneholder mer uampet syrer, som viser stor affinitet for oksidasjonsmidler (Lugol).

Gram -negative bakterier har en tynn kappe av peptidoglykan, noe som gjør at bakterier danner mindre kompleks enn gram -positiv.

Deretter kommer trinnet med misfarging, der gram -positive og gram -negative bakterier oppfører seg annerledes.

Gram -negative bakterier inneholder en ytre membran rik på lipopolysakkarider som er en del av celleveggen. Fett blir ødelagt ved kontakt med acetonalkohol, så den ytre membranen er destabilisert, det fiolette glasset blir frigitt.

Slik blir det senere ansatt med den grunnleggende Safranine eller Fuchsin, og tar den røde fargen.

Når det gjelder gram -positive bakterier, motstår de misfarging fordi blekemiddelet virker ved.

Derfor er farge med det fiolette glasset stabilt, og det er ikke noe sted for Safranine eller Fuchsin. Derfor er disse bakteriene farget intense eller lilla.

Materialer

Grams fargesett er sammensatt av:

- Fiolett glass.

- Lugol.

- Acetonalkohol.

- Grunnleggende Safranine eller Fuchsin.

Forberedelse av fargestoffer og reagenser

Fiolett krystallløsning

Løsning på:

Violet Crystal - 2 Gr

95% - 20 cc etylalkohol

Løsning B:

Ammoniumoksalat - 0.8 gr

Destillert vann- 80 cc

For den endelige tilberedningen av det fiolette glasset, må løsningen til 1:10 fortynnes med destillert vann og blandes med 4 deler løsning B. Blandingen lagres i 24 timer før den bruker den. Den filtreres i en ravfargingsflaske ved hjelp av et papirfilter.

Det kan tjene deg: Chiapas Flora og Fauna: Representative arter

Mengden som brukes daglig flyttes til en ravflaske med dropper.

Jod-lugol

Vei og måle den angitte mengden av hver forbindelse, som følger:

Jodkrystaller - 1 gr

Kalium Ioduro - 2 GR

Destillert vann - 300 cc

Kaliumjodidet er oppløst litt etter litt i vannet, og deretter tilsettes jodet. Løsningen på en ravflaske overføres.

Mengden som brukes daglig flyttes til en mindre ravflaske med dropper.

Diskonserer

95% etylalkohol - 50 ml

Aceton - 50 ml

Det er utarbeidet i like store deler. Dekke godt, fordi det har en tendens til å fordampe.

Bottero i fut.

Denne forberedelsen gir en moderat tids misfarging 5-10 sek., Og det er det mest anbefalte.

Beginters foretrekker å bruke bare 95%etylalkohol, der misfargingen er tregere, fra 10 til 30 sekunder.

Mens de mest erfarne kan bruke ren aceton, hvor misfarging skjer veldig raskt fra 1 til 5 sek.

Kontrast

Safranine Mother Solution

Safranine - 2.5 gr

95%etylalkohol - 100 cc

Etter å ha veid den indikerte mengden Safranine, oppløses den ved 100 cm3 etylalkohol ved 95%.

Fra morsløsningen er arbeidssafraninløsningen utarbeidet.

For å gjøre dette, må du måle 10 cm av morsløsningen, tilsett 90 cm3 destillert vann for å fullføre 100 ml.

Det anbefales å overføre beløpet som brukes daglig til en ravflaske med dripper.

Mikroorganismer som er farget svakt med Gram-Huckers farging, som visse anaerober, Legionella SP, Campylobacter sp og Brucella sp, De kan beises mye bedre hvis modifiseringen av Kopeloff gjør til farging av gram-hucker, kalt Gram-Kopeloff-farging laget.

Denne teknikken endrer Safranine -fargestoffet for grunnleggende fuchsin. Med denne modifiseringen er det mulig å effektivt fargelegge de nevnte mikroorganismer.

Reagenslagring

Forberedte fargestoffer må lagres ved romtemperatur.

Forberedelse av den utvidede prøven til fargelegging

En prøve må inneholde minst 10⁵ Mikroorganismer før observasjonen er sannsynligvis i en smøre. Utvidede kan utføres fra den direkte prøven eller avlingene i faste eller flytende medier.

De utvidede må være ensartede, godt fordelt og ikke veldig tykke, for en bedre visualisering av strukturene som er til stede.

Gram av direkte prøver

Gram urin uten sentrifuging

Urinen er blandet og 10 ul plasseres på et lysbilde. Observasjonen av minst en bakterie/fordypningsfelt indikerer at det er infeksjon.

Dette betyr at avlingen vil ha omtrent mer enn 100.000 UFC/ml (10⁵ UFC/ml) urin i 85% av tilfellene.

Denne metoden er ikke nyttig for kolonitall under 100.000 UFC.

Gram av CSF

CSF skal være sentrifuge, supernatanten fjernes og sedimentet strekker seg i et lysbilde. Denne væsken er steril under normale forhold. Bakterierobservasjon indikerer infeksjon.

Kan tjene deg: saltkjertler

Gram luftveisprøver

Sputum gram, bronkial eller broncoalveolar vasking, selv om det kan være en rekke mikroorganismer, vil det alltid lede diagnosen, i tillegg til å være nyttig typen celle som er observert.

Når det gjelder Esputo, må den utvidede med de mest purulente delene av prøven utarbeides.

Avføring gram

Det anbefales ikke å lage gram til denne typen prøver, siden den ikke har noen diagnostisk verdi.

Gram av avlinger

De kan gjøres på to måter, en fra flytende avlinger og en annen fra solide avlinger.

Flytende avlinger

Fra flytende avlinger er det ekstremt enkelt: under lettere blir flere steker av den grumsete buljongen tatt og plassert på en ren og tørr lysbilde, noe som gir sirkulære bevegelser fra sentrum til periferien, for å fordele materialet jevnt.

Det er tillatt spontant å lufte. Når det er tørt, er materialet festet til arket med varme. For å gjøre dette, ved hjelp av en klemme passerer du arket 3 til 4 ganger gjennom flammen på bunsen lettere, forsiktig så du ikke brenner materialet.

Arket har avkjølt og plassert på fargebroen.

Solide avlinger

For å utføre en utvidet gramfarging fra en solid avling, fortsett som følger:

Før du velger koloniene som skal tas, må du tilberede sporet Lamb, og plassere omtrent to dråper steril fysiologisk saltvann.

Hvis den opprinnelige dyrkingsplaten inneholder flere typer forskjellige kolonier, vil en isolert koloni av hver og en bli valgt for å utføre gram. Hver koloni vil bli tatt med platinahåndtaket for å oppløse den i saltoppløsningen som tidligere er plassert på lysbildet.

Sirkulære bevegelser er gitt fra sentrum til periferien, for å homogent fordele kolonien i lysbildet.

Det er tillatt spontant å lufte. Når det er tørt, er arket festet med varme, som forklart ovenfor (flammer sporet med lighteren), og pass på å ikke brenne materialet.

Denne prosedyren må utføres med hver annen type koloni. Rekkefølgen på det som er observert, for eksempel:

Colonia 1: Betahemolytisk gult Colonia: Gram -positive kokosnøtter ble observert i klynger.

Colonia 2: Cream Colonia, uten hemolyse: Gramnegative kokobaciller ble observert.

Hvert ark må være merket for å vite hva vi observerer.

Teknikk

Grams fargesteknikk er ekstremt enkel å utføre og relativt økonomisk, og kan ikke mangle i et mikrobiologilaboratorium.

Det gjøres som følger:

1. Sett utstrykningen med varme og legg på fargebroen.
2. Arket er fullstendig dekket med fiolett glass med 1 minutt.
3. Vask med vann. Ikke tørk.
4. Dekk arket med Lugol -løsning, la handle i 1 minutt. Vask med vann. Ikke tørk.
5. Dekorere 5-10 sekunder med myk omrøring i acetonalkohol. O Plasser arket vertikalt og slipp avfarging dråper på overflaten til det drar reserve av fiolett krystall. Ikke overskrid.
6. Vask med vann. Ikke tørk.
7. Plasser arket på fargebroen og dekk med 30 sekunder med Safranine (Gram-Hucker) eller 1 min med Basic Fuchsina (Gram-Kopeloff).
8. Vask med vann.
9. Slipp spontant ut i luften i vertikal stilling.

Det kan tjene deg: flora og fauna

Når det er tørt, legg 1 dråpe nedsenkningsolje for å observere den under målet av 100 ganger i det optiske mikroskopet.

Bruker/applikasjoner av Gram -farging

- Denne teknikken gjør det mulig å skille morphotintorialforskjellene til de fleste bakterier.

- Gjær skilles også med denne fargen. De tar det fiolette glasset, det vil si at de er farget gram -positivt.

- Du kan skille gram -positive sporer baciller, der et klart rom blir observert i bacillusen der endosporaen ble dannet, selv om sporer ikke er godt farget. For å farge sporer brukes andre teknikker, for eksempel Shaeffer-Fulton.

- Hjelper med å bestemme hvilken type antibiotika som må utarbeides.

Det skal bemerkes at denne fargingen Det fungerer ikke For å fargelegge alle typer bakterier, det vil si at det er tilfeller der farging ikke fungerer.

I disse tilfellene kan bakterier som mangler cellevegg nevnes. For eksempel: kjønn Mycoplasma, sfæroplast, Ureaplasma, L Former og protoplaster.

I tillegg bakterier med bakterier rike på mykolsyrer, som mykobakterier og intracellulære bakterier, som klamydias og rickettsias.

Det er også ineffektivt å farge mest spirokjemale bakterier.

Det er bakterier av samme slekt som kan observeres i samme prøve som gram -positivt og som gram -negativ. Når dette skjer, kalles det variabel gramfarging, noe som kan skyldes endring i næringsstoffer, temperatur, pH eller elektrolyttkonsentrasjon.

Vanlige feil

Dekorere overdrevet

Overdrive i misfargingspasset kan forårsake observasjon av falske gram -negative mikroorganismer.

Ikke vent på nok tørketid til å tilsette nedsenkningsoljen

Denne feilen fører til at fettmiceller danner som hindrer observasjonen av strukturene som er til stede. Dette skjer når oljen blir sammen med vannmolekylene som er til stede i lukten.

Invester rekkefølgen på reagenser

En feil som denne vil generere gram -negative bakterier som skal visualiseres, det vil si falsk gram -positivt.

Bruk gamle avlinger (faste stoffer eller væsker)

Det kan føre til at gram -positive bakterier flekker gram -negativ (gram -negativ falsk). Dette skjer fordi det i gamle avlinger er sannsynlig at det er døde eller forverrede bakterier, og under disse forholdene beholder ikke bakteriene det fiolette glasset.

Bruk veldig gammel Lugol -løsning

Over tid mister Lugol sine egenskaper og fargen falmer. Hvis det allerede degenererte reagenset brukes, vil dette ikke fikse det fiolette glasset godt, derfor er det en mulighet for å oppnå en visualisering av falsk gram -negative mikroorganismer.

Blå bakgrunn

En ordentlig misfarget bakgrunn vil være rød. En blå bakgrunn indikerer at misfargingen var utilstrekkelig.

Referanser

1. Hus-Rincón, g. (1994). Generell mykologi. Central University of Venezuela.
2. Gramfarging. Hentet fra det.Wikipedia.org.
3. González, m., González, n. (2011). Medisinsk mikrobiologihåndbok. Media and Publications Directorate of University of Carabobo.